划重点! 全面解读“新版欧盟农药登记”分析方法指南 SANCO/3030/99 rev.5

农药登记
2019年8月7日

从事农药登记工作的朋友们对分析方法指南文件SANCO/3030/99都不陌生,这份导则是5批次测试中最重要的一份参考导则。5批次分析报告不仅是农药登记最基础也是最重要的资料之一,同时也是企业进军欧盟市场进行原药等同性评估(TE评估)时最重要的一份资料。不仅如此,按照SANCO/3030/99里面的要求开展测试,报告不仅适用于欧盟,也被众多其他国家或地区的农药管理官方接受,可以说,SANCO/3030/99的国际认可度非常高。

简单来讲,SANCO/3030/99是欧盟委员会批准的适用于欧盟农药登记的分析方法指南,里面涵盖了对农药原药和制剂登记以及登记后监管的分析方法要求。今年3月22日,欧盟发布了最新版的SANCO/3030/99指南(第5版),适用于2019年10月1日之后提交的农药登记申请卷宗。我们知道第4版 SANCO/3030/99 在2000年发布的时候,欧盟农药管理法规还没有更新,在使用了19年之后,这次指南文件的更新,有哪些亮点值得关注呢?

总的来讲,这次指南文件的更新主要结合了近20年来分析化学的技术发展以及欧盟各成员国和EFSA处理实际申请项目的经验。更新的主要目的是使SANCO/3030/99能与欧盟现行农药法规1107/2009下原药和制剂的登记数据要求,即regulations (EU) No. 283/2013和 regulations (EU) 284/2013,更加协调统一。

具体更新内容有以下几点:

一、相关定义更加明确,与数据要求指南里面的定义更统一;

二、对验证参数要求的解释和优化,使新版指南更具有可操作性,更符合实际情况;

三、对待测物身份验证的说明更加清晰具体;

四、其他一些值得关注的点。

一、定义更加明确

SANCO/3030/99第5版与第4版相比,对指南文件里提到的相关定义描述更加明确。与数据要求指南No. 283/2013 和 No. 284/2013里面的定义更加协调和统一。主要表现在以下几个方面:

1、对于验证参数准确度的定义更加明确

新版指南对准确度的定义指出,准确度是回收率和精密度的总和。与此相对应,新版指南的其中一个验证参数由原来的准确度改为回收率。在第4版指南文件里面,分析方法需要进行方法准确度的验证,而准确度一般由回收率来体现,一般认为,准确度和回收率是等同的。

2、提出了相关助剂概念

但是相关助剂的具体定义仍不明确,欧盟层面的助剂工作小组正在制定。目前,欧盟层面助剂统一的管理文件,1107法规附件III关于欧盟禁用助剂的清单尚未发布。

3、增加待测物身份验证定义

待测物身份验证,是为了确定检测仪器所给出的信号确实是我们认为的那个结构的物质所给出的,是物质鉴定的一部分。通过确定待测物的结构特征,并与标准品比对,鉴定待测物身份。新版指南增加了这一定义,与数据要求regulations (EU) No. 283/2013和 regulations (EU) 284/2013里面物质身份鉴定部分统一。具体对于身份验证的方法要求,将在后面待测物身份验证部分详细论述。

4、增加空白制剂定义

空白制剂,即安慰剂。即制剂产品除被试活性物质以外的其他所有成分组成的样品。这就要求登记申请者在开展制剂含量测定时,提供不含活性物质的空白制剂。从试验对照的角度出发,设置空白制剂对照,更为科学合理。

5、增加纯物质、原药和母药以及添加剂的定义

与数据要求regulations (EU) No. 283/2013和 regulations (EU) 284/2013更为协调统一。

6、修改杂质定义:

新版指南文件里面,关于杂质的解释如下:除了活性物质和添加剂之外的任何其他组分,主要来源于生产过程,或者是贮存过程中发生的降解,包括没有活性的活性物质异构体。与旧版定义相比,新的定义把添加剂的概念融合进去了,更加合理。

二、对验证参数的标准要求和解释更为合理

我们知道分析方法验证的目的,是确定在方法正确使用的基础上,其产生的结果与方法的目的相符。如何进行方法验证呢?一般从以下几个方面进行,验证方法的特异性、线性、回收率、精密度、定量限等。从一定程度上来说,与旧版指南相比,新版指南对验证要求的接受标准放宽,更加关注方法本身的适用性,而不是单纯要求符合硬性接受标准。

是不是所有的分析方法都需要进行验证呢?对于原药的分析,如果检测方法来自国际农药分析协作委员会(CIPAC), 欧洲标准化委员会(CEN),国际标准化组织(ISO),分析化学家协会(AOAC),这些方法视为验证过的方法,只用提供特异性验证即可,无需其他验证数据。新版指南里面,对于原药的分析方法,增加了CEN和ISO方法,作为验证过的方法。对于制剂的分析,新旧指南描述一致。如果分析方法属于CIPAC方法和AOAC方法,除了特异性验证之外,也无需提供其他验证数据。

对于除上述方法之外的其他分析方法,则要求进行验证。下面将从原药方法验证要求出发,进行新旧指南的对比。

表1-原药5批次分析方法验证要求新旧指南对比

验证参数

新版要求

旧版要求

特异性

增加对光学异构体的说明。如果欧盟批准的活性物质是消旋混合物,则不需要分析方法确定各个异构体的比例。反之,则需要提供对异构体有选择性的方法。

通过空白样品、标样和待测样对比确定方法特异性,要求其他组分的干扰不超过峰面积的3%。

线性

与旧版相比,回归系数要求放宽,若r2≥0.98,也可以接受;同时给出非线性拟合的例子(指数、对数关系),如果使用的检测方法能够达到目的,非线性的结果也是可以接受的。

标样配制3个浓度,每个浓度重复2次,或者5个浓度及以上,每个浓度测一次; 提供标准曲线、线性方程以及回归系数; 接受标准:线性范围涵盖待测物浓度±20%,r>0.99。

回收率

明确了2种回收率计算方法,待测物初始含量在加标量10%以下,计算total recovery;待测物初始含量在加标量10%以上,计算marginal recovery; 活性成分验证接受标准放宽,和杂质验证标准统一。见新版指南Appendix 2

一般采用标准加入法测量回收率,至少测定2个浓度水平。

精密度

明确指出重复测量的样品必须是独立称取所配制的浓度相同的样品。

新版导则Appendix 2提到,测试的RSD结果与Horwitz value RSDr比值大于1的情况,只要解释合理,也可以接受。

 

样品至少重复5次,计算RSD。要求 RSD小于可接受的Horwitz value RSDr,即二者比值小于1。

定量限LOQ

原药中杂质分析方法不再需要确定LOQ,但是分析方法必须在显著杂质的浓度水平及相关杂质浓度低20%的水平处进行回收率和精密度的验证。

对于原药中的杂质分析,确定LOQ,并且在LOQ水平进行回收率和精密度的验证。

制剂相关分析方法的验证与原药的类似,不过对于相关杂质和相关助剂的验证,定量限LOQ仍旧是需要的。如果理论上需要达到的LOQ过低而无法进行验证,则需要在可以验证的最低浓度处进行LOQ的验证。另外,还需提供充分的资料说明理论上需要的LOQ无法达到,实际验证的LOQ数值已经能够满足风险评估的要求。

三、对待测物身份验证的说明更加清晰具体

对于杂质的检测,如果使用的主要方法不是高特异性的方法,需要用不同的方法开展额外的测试验证待测物身份。那么如何确定方法的特异性,来进行待测物身份验证呢?指南文件附件4增加了对分析方法特异性的说明,对特异性方法、非特异性方法和高特异性方法进行了具体的描述和举例,使登记申请者和实验室在开展测试之前更加明确法规要求,选择合适的符合要求的分析方法。

非特异性方法

任何一种定量是基于被试物含有的官能团而不是特定物质的分析方法。(例如滴定法)

特异性方法

HPLC 或者GC方法, 对比被试物和标样的保留时间;

HPLC-DAD方法,对比被试物和标样对应色谱峰的紫外谱图的吻合度

 

高特异性方法

HPLC-MS/MS或者LC-MS/MS,有2个裂解过程,同时对比被试物和标样的保留时间;

GC-MS、LC-MS有至少3个离子(理想情况下m/z >100),同时对比被试物和标样的保留时间;

色谱保留时间加其他谱图(IR, NMR, MS),或直接采用多种其他谱图;

HPLC-UV改变流动相或固定相以改变选择性;

高分辨率质谱,有2个代表型离子 m/z偏差在0.003以内;

如果使用了滴定法这样的非特异性方法,应该说明由于什么技术条件限制没有使用特异性更好的方法。目前对于一些常见的物质例如水分、氯化钠等的测定,一般都是采用的滴定法,如果这些方法被列为CIPAC方法,除了选择性之外,一般也无需进一步验证。

四、其他值得关注的变化

1、实验使用溶剂的要求:

此外,对实验过程中使用的溶剂做了要求,新版指南提到,应避免使用高毒溶剂,例如根据欧盟法规76/769/EEC 归为致癌1类和2类的物质,比如:氯仿、重氮甲烷、苯。这一要求,也是出于对实验操作人员的健康安全考虑,与GLP管理的要求更为统一。

2、参考文献的增加和修订

前面提到,新版指南的修订结合近二十年来分析化学的技术发展成果,同时,也参考了医药领域对于分析方法要求的指南文件,详见新版指南参考文献部分。

总之,新版指南与旧版相比,结合了新版农药法规下的原药和制剂数据要求,更加符合原药和制剂定性定量分析的实际情况,也为登记申请者和相关实验人员提供了更加清晰明确的指导。那么在实际委托测试的过程中应该注意哪些问题呢?

五、实际委托测试报告注意点

如果要准备原药5批次分析报告或者制剂稳定性测试报告用于欧盟地区的农药登记,登记申请者在实际委托测试过程中,应该对实验室的分析能力和对欧盟法规要求的了解程度进行评估,同时明确要求实验室按照SANCO 3030/99 rev.5中的要求对分析方法进行验证。

结合我们在欧盟TE评估中丰富的经验,在实际审核报告的过程中,我们发现,以下几个方面最容易出现问题:

1、特异性:部分实验室出具的报告中,不含特异性验证部分,或者虽包含这部分的验证结果说明,但是没有附上空白、标样以及样品的比对谱图。

2、线性:部分实验室出具的报告,关于线性验证部分,没有满足指南要求:例如,线性浓度范围不涵盖待测样浓度或者涵盖待测物浓度但是不满足±20%的条件,报告没有标注线性浓度(mg/L)范围所对应的待测物在待测样中的质量百分比(%w/w),线性方程的回归系数计算不合理等;其中溶液浓度(mg/L)与其所对应的待测物在待测样中的质量百分比(%w/w)是目前测试报告中缺失最多的内容,也是新指南在第2.4部分新增的必须包含在方法的描述中的内容。

3、精密度:报告里面未对测试精密度RSD与Horwitz value RSDr进行比较或者比Horwitz value RSDr大,但是报告里面没有对此结果的解释说明;还有的测试报告缺少对出现的离群值的解释说明。

4、定量限:部分实验室出具的报告里面,对于杂质LOQ的确定,只提供了理论值,没有在该浓度水平进行回收率和精密度的验证; 另外,部分报告只提供了LOQ所对应的溶液浓度值(mg/L),而没有与之对应的待测物在待测样中的质量百分比(%w/w),报告审核者或者官方不能快速判断该验证参数是否符合验证要求。

5、待测物身份验证:部分报告采用HPLC或者GC方法,报告里面只有和标样保留时间的对比,而没有其他谱图,待测物身份进行验证不充分。

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